FRACIONAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DA APITOXINA
Amazile B.R.A. Maia (1,2) & Maria Patrícia S.
Rocha (1)
(1) Engenheira química (2) Mestre em Alimentos, Doutora em Bioquímica
LABM Pesquisa e Consultoria - Belo Horizonte, MG (labm@labm.com.br).
Apoio financeiro: CNPq/RHAE e LABM
RESUMO
A apitoxina é um produto de extrema importância para a terapia da artrite e
de grande valor no mercado internacional. Contudo, o produto brasileiro ainda
tem uma participação restrita neste mercado, devido à carência de protocolos
analíticos para atestar sua pureza e alergenicidade. Procurando suprir esta
deficiência, caracterizou-se o perfil por cromatografia em coluna de quatro
amostras de procedência conhecida (duas do Paraná, uma de Santa Catarina e uma
de Minas Gerais). Alíquotas de 150 mg foram fracionadas em coluna de gel de
Sephadex G-50 fine, recolhendo-se cerca de 300 frações cujas absorbâncias foram
lidas em 280 nm. Três amostras apresentaram perfis praticamente idênticos, formados
por dois picos pequenos e um terceiro bastante acentuado. No perfil da quarta
amostra, os dois primeiros picos foram semelhantes às demais, mas o terceiro
foi menos acentuado e apareceu ainda um quarto pico. Nesta amostra, determinaram-se
o teor de proteínas solúveis e a faixa de pesos moleculares nos pool's das frações
correspondentes a cada pico. Evidenciou-se que os componentes alergênicos foram
recolhidos no primeiro (hialuronidase) e segundo (fosfolipase A2) picos; a melitina
(principal agente terapêutico) concentrou-se no terceiro pico, que continha
cerca de 50% das proteínas totais. O quarto pico continha parte dos componentes
de menor peso molecular do terceiro. O fracionamento mostrou-se um recurso simples
e potencialmente aplicável tanto para aferir a ausência de adulterantes como
para obter frações da apitoxina com potencial alergênico atenuado.
Palavras-chave: apitoxina, veneno de abelha, fracionamento em gel, alergenicidade
1) INTRODUÇÃO
A apitoxina (veneno da abelha Apis mellifera) é uma mistura complexa de compostos
orgânicos, incluindo enzimas, proteínas, peptídeos e aminoácidos isolados, que
correspondem a mais de 90% do seu peso seco. A parte restante compõe-se de carboidratos
e fosfolípides, em geral ligados quimicamente aos compostos nitrogenados. Quando
fresca, contém 80 a 85% de água. (3, 15, 16). Suas propriedades anti-artríticas
são historicamente reconhecidas. Sabe-se que Hipócrates (460 A.C.) já empregava
ferroadas de abelha em seus procedimentos terapêuticos. Carlos Magno, no século
VIII de nossa era, foi tratado com ferroadas de abelha para combater inflamações
nas juntas (4).
A artrite é uma doença das juntas que causa dor intensa, restringe o movimento
e até deforma o paciente. Não tem cura, sendo usualmente controlada por meio
de drogas esteróides (cortisona, prednisona e dexametasona...), que são fortemente
irritantes do sistema gástrico. Além disso, seu uso prolongado está relacionado
a sérias complicações nas glândulas adrenal e pituitária, podendo ainda causar
edema, queda da resposta imunológica, crescimento excessivo dos cabelos, irregularidades
cardíacas e impotência (4, 7).
Ao longo da segunda metade do século XX, estudos científicos comprovaram as
propriedades terapêuticas da apitoxina (4, 5, 20, 21, 22 entre outros). Em 1992,
por exemplo, após acompanhar o tratamento com veneno de abelha em 108 pacientes
artríticos que não tinham obtido sucesso nas terapias tradicionais, KIM (11)
concluiu que, desde que o paciente não seja alérgico, a terapia do veneno é
segura e altamente efetiva, sendo isenta de efeitos colaterais.
Os efeitos terapêuticos são atribuídos principalmente à melitina, peptídeo de
peso molecular 2.846 D, que corresponde a cerca de 50% do peso seco da apitoxina
(14, 18). As reações alérgicas, que atingem cerca de 1-2% da população, são
atribuídas, principalmente, às enzimas fosfolipase A2 e hialuronidase. No veneno
de abelhas, a primeira tem peso molecular em torno de 11.000 (1, 2, 9) e a segunda
em torno de 40.000 D (6, 8, 10, 13).
No mercado internacional, a apitoxina chega a atingir 300 dólares o grama (17).
Contudo, a participação neste mercado depende acentuadamente de garantias de
pureza e qualidade. O objetivo deste trabalho foi testar a aplicação do Sephadex
G-50 fine como recurso: (a) para se aferir a pureza da apitoxina bruta, mediante
caracterização do perfil cromatográfico; (b) para se obter frações da apitoxina
que associem ação terapêutica com alergenicidade reduzida.
2) MATERIAL E MÉTODOS
Foram fracionadas quatro amostras de apitoxina, fornecidas pela CONAP (Cooperativa
Nacional de Apicultores - Belo Horizonte), sendo uma de Minas Gerais, uma de
Santa Catarina e duas de diferentes regiões do Paraná (Paraná "1" e "2"). A
coluna cromatográfica (vidro transparente, diâmetro interno 14,5 mm e altura
1950 mm) foi previamente testada com resinas de Sephadex G-25 medium e G-50
medium e fine, utilizando alíquotas de uma das amostras. Pelos resultados preliminares
selecionou-se a resina de Sephadex G-50 fine. Para cada fracionamento, uma alíquota
de 150 mg do veneno foi diluída duas vezes em 1,0 mL de solução tampão de formiato
de amônio (pH 4,5) e centrifugada (10.000 rpm/5 min.). Reuniram-se os sobrenadantes,
eluindo a mistura com a solução tampão, à vazão de 7,8 mL/h. Foram recolhidas
cerca de 300 frações, a intervalos de 10 minutos, medindo-se as respectivas
absorbâncias em 280 nm. Pelo gráfico dos resultados (Figura 1) foram caracterizados
os perfis cromatográficos das amostras. Em uma delas (Paraná-2) as frações correspondentes
aos picos foram reunidas em pool's, nos quais foram determinados os teores de
proteínas solúveis, conforme LOWRY et al. (12). Os pool's foram então liofilizados
e pesados, sendo redissolvidos em volumes definidos de solução tampão de formiato
de amônio 1 mM, para serem dialisados em membrana Spectra Por (porosidade 2000
D) e submetidos a eletroforese em placa de SDS PAGE 17,5%. Após revelação por
coloração Prata (19), os pesos moleculares das bandas evidenciadas foram estimados
mediante comparação com padrões de peso molecular conhecido na faixa de 2.520
(mioglobina) a 66.000 (albumina bovina).
3) RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1- Perfis cromatográficos
Na Figura 1(a) encontram-se os perfis cromatográficos de três amostras (Minas
Gerais, Santa Catarina e Paraná-1). Observa-se que os resultados foram praticamente
idênticos, consistindo de dois picos iniciais, de menor tamanho, e um terceiro
bastante acentuado. Em (b) apresentam-se os perfis de duas amostras do mesmo
Estado (Paraná-1 e Paraná-2). À diferença das demais, observa-se que, na amostra
Paraná-2, o terceiro pico foi de menor tamanho, sendo que ocorreu ainda um quarto
pico. Esta amostra foi selecionada para os testes subseqüentes.
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Figura 1 - Perfis cromatográficos em gel de Sephadex G-50 fine de amostras de apitoxina brasileira bruta de diferentes procedências
3.2- Caracterização dos picos
Além dos pool's correspondentes aos quatro picos evidenciados pela amostra Paraná-2,
foi constituído um quinto pool com 50 tubos posteriores ao último pico, que
mostraram absorbâncias entre 0,05 e 0,22. As leituras abaixo de 0,05 foram desprezadas.
Na Tabela 1, apresentam-se os teores de proteínas de cada pool.
Tabela 1
Teores de proteínas nas frações da apitoxina bruta (amostra Paraná-2)
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Pool |
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Na Tabela 2, encontram-se as faixas de peso molecular das bandas evidenciadas pelos pool's no teste de eletroforese. O pool 5 não apresentou bandas, indicando que a maior parte de seus componentes tinha peso molecular abaixo de 2.000 D, sendo, por este motivo, removidos juntamente com os sais, durante a diálise.
Tabela 2
Faixas de pesos moleculares da apitoxina (Paraná-2)
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Pool |
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(*) presumida face à ausência de bandas na eletroforece
Juntos, os pool's 3 e 4 da apitoxina Paraná-2 continham acima de 50% dos componentes nitrogenados (Tabela 1) com pesos moleculares entre 2 e 7 mil daltons (Tabela 2). Nas demais amostras fracionadas (Figura 1-a) não ocorreu um quarto pico. Nelas, porém, a área do terceiro pico foi acentuadamente superior à da amostra caracterizada. Assim, pode-se inferir que seus teores de peptídeos na faixa de baixo peso molecular eram equivalentes ou até mesmo superiores aos da amostra Paraná-2. Nesta última, pode-se considerar a ocorrência do pico 4 como um desdobramento ocasional do pico 3, correspondente à sua faixa inferior de peso molecular. Observando as faixas de pesos moleculares correspondentes aos picos iniciais (Tabela 2), pode-se inferir que os alergênicos hialuronidase e a fosfolipase A2 foram recolhidos, respectivamente, no primeiro e segundo picos.
4) CONCLUSÃO
O fracionamento em coluna de Sephadex G-50 fine permitiu tipificar o perfil
cromatográfico da apitoxina bruta e isenta de contaminantes, que está relacionado
às proporções específicas de seus componentes nitrogenados nas diversas faixas
de peso molecular. A aplicação deste procedimento a amostras de procedência
desconhecida constitui um primeiro recurso para aferição de sua pureza. Ocorrendo
divergência do padrão esperado, deve-se efetuar a dosagem de proteínas em cada
pico e verificar as faixas de peso molecular correspondentes. A cromatografia
em coluna associa simplicidade operacional com baixo custo, podendo ser empregada
em grande número de laboratórios. Com isso, espera-se contribuir para reforçar
a credibilidade do produto nos mercados interno e internacional, resgatando
seu importante e talvez insubstituível papel na terapia da artrite.
5) REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1- AMERATUNGA R. V. et al. A high efficiency method for purification and assay
of bee venom phospholipase A2. Pathology, 27 (2): 157-60. 1995,
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bee venom phospholipase A2. Int. Arch. Allergy Immunol., 117 (1): 1-10. 1998.
3- BLUM, M. S. Chemical defenses in arthropods. New York, Academic Press, 1981.
4- BROADMAN, J. Bee Venom - The Natural Curative for Arthritis and Rheumatism.
New York: Putnam and Sons. 1962. 224 p.
5- CHANG,Y.H & BLIVEN,M.L. Anti-arthritic effect of bee venom, Agents Actions,
9: 205-11. 1979.
6- COTTRELL, R.C. Phospholipase A2 from bee venom. Methods Enzymol., 71: 698-702.
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10- GMACHL, M. & KREIL, G. Bee venom hyaluronidase is homologous to a membrane
protein of mammalian sperm. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 (8): 3569-73. 1993.
11- KIM, C.M.M. Bee venom therapy and bee acupuncture therapy (Medical textbook
for physicians and acupuncturists. Seul, South Korean Ed., 1992. 550 p.
12- LOWRY, O.H. et al. Protein measurememt with the folin phenol reagent. J.
Biol. Chem., 193: 265-75. 1951.
13- ORLOV,B. N. et al. Sur quelques propriétés du venin d'abeille. XXVIII Apimondia
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14- SAINI,S.S. et al. Melittin binds to secretory phospholipase A2 and inhibits
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15- SCHMIDT, J. O. In: PIEK, T. Ed. Venoms of the hymenoptera. London. .Academic
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16- SCHMIDT, P. J. et al. The detoxification of ant (Pogonomyrmex) venom by
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