Fora dito, por ocasião da primeira publicação do artigo "Novas Fronteiras para a Própolis" (publicado na revista Mensagem Doce de Setembro/2001), que encontrava-se em andamento na Universidade Federal de Viçosa (UFV-MG), pesquisas para estudar a aplicabilidade da própolis como aditivo nutricional para ruminantes. Em face dos resultados recentemente obtidos no Departamento de Zootecnia da referida instituição, vimos apresentá-los aos leitores desta revista. Importante para o perfeito entendimento desse novo artigo é que seja lido o artigo de setembro passado.

    Esses novos resultados referem-se à potencialidade da própolis, por ação ionófora, em inibir a produção de gases (principalmente metano) na fermentação ruminal, utilizando-se técnica de fermentação in vitro (procura reproduzir o que ocorreria no rúmen quanto à produção de gases à partir da fermentação de substratos alimentares pelas bactérias ruminais), via ação ionófora (ler artigo setembro). Cabe aqui uma consideração especial quanto à possibilidade técnica de se conseguir a inibição da produção de gases nos ruminantes, pelo fato dessa ocorrência resultar em algo mais que somente a melhoria no desempenho animal pela conservação de energia (a energia que seria perdida na forma de metano é aproveitada). Trata-se da possibilidade de, através da manipulação ruminal, obter-se menor liberação de gás metano para a atmosfera (gás poluente responsável pela destruição da camada de ozônio). Esses gases são liberados através da eructação decorrente do exercício de ruminação realizada por esses animais para melhor aproveitamento da dieta. Dietas ricas em fibra favorecerem a produção de metano nesses animais¹, sendo essas fibras a base dessa alimentação, através de alimentos volumosos (capins, cana, silagens, feno) que compõem, em maior proporção, via de regra, suas dietas. Ressalta-se, no entanto, que embora sejam os ruminantes os animais que mais contribuem para a emissão de metano na atmosfera (27% do total), esta fonte de emissão é possível de ser manipulada para sua diminuição, o que constitui-se em aspecto altamente positivo.
 

Ação dos Extratos de Própolis sobre a Produção de Gases na Fermentação
in vitro de Diferentes Alimentos
 
 

Introdução

    Em ruminantes, a fermentação de alimentos ingeridos produz ácidos graxos voláteis (AGV), amônia, gases (dióxido de carbono e metano) e células microbiais. Para o animal hospedeiro (o ruminante), os AGV’s constituem a maior fonte de energia (65 a 75% da energia metabolizável ingerida). Entretanto, a produção de gases (dióxido de carbono e metano) representa uma grande perda de energia ingerida no alimento. Segundo LANA et al. (1998), a produção indesejável de gás metano pelas bactérias ruminais e intestinais (Methanobrevibacter spp. e Methanomicrobium mobile) corresponde a uma perda energética de até 13% em relação à energia do alimento ingerido. Em adição a isso, o gás metano que é eliminado pelos ruminantes, por eructação, é um dos principais responsáveis pelo efeito estufa e pela destruição da camada de ozônio da atmosfera. Deve-se considerar que um bovino adulto chega a produzir mais de 400 litros de gás por dia ( metano + dióxido de carbono), liberado no meio, principalmente por eructação e que hoje o rebanho bovino mundial é de mais de 1 bilhão de cabeças (ANUALPEC 2001). Conforme CRUTZEN et al (1986), os ruminantes são responsáveis por 15% do total de metano emitido na atmosfera terrestre. MADIGAN et al. (1997) alertaram para o fato dos ruminantes serem os animais que mais contribuem para a emissão de metano na atmosfera.

    Essa produção de gases no rúmen está intimamente relacionada com a produção de AGV. A fermentação de carboidratos e proteínas que resulta em produção de AGV no rúmen é acompanhada pela produção de hidrogênio. Segue que somente uma pequena parte deste hidrogênio é usada para crescimento microbiano e na saturação de ácidos graxos de cadeia longa, mas a maior parte é utilizada por bactérias metanogênicas para produção de metano.

    Manipulações da fermentação ruminal que priorizem o aumento da produção de propionato, a exemplo de aditivos ionóforos, implicam, consequentemente, na diminuição da produção de metano no rúmen. Ocorre que no ecossistema ruminal existe uma relação inversa entre a produção de metano e a de ácido propiônico. O mecanismo pelo qual se justifica essa relação inversa consiste em direcionar os hidrogênios e carbonos que estariam disponíveis para metanogênese, excedentes na produção de acetato (2C), deslocando-os para a produção de propionato (3C). Logo, uma das formas de atuação dos ionóforos seria inibindo a ação das bactérias gram-positivas produtoras de acetato, porém, não inibindo o crescimento das bactérias gram-negativas produtoras de succinato e propionato (RUSSEL & STROBEL, 1989). Isto traria uma redução na relação acetato:propionato no rúmen promovendo uma redução na produção de metano, consequentemente, aumentando a eficiência energética dos ruminantes e diminuindo a emissão de metano a atmosfera.

    Segundo MIRZOEVA et al. (1997), a própolis e alguns de seus componentes possuem efeitos sobre a permeabilidade da membrana interna bacteriana aos íons, causando a dissipação do potencial de membrana, o que a caracteriza como substância ionófora.

    Diversos trabalhos têm demonstrado que a atividade antimicrobiana da própolis ocorre pela inibição de bactérias classificadas como gram-positivas (GHISALBERTI,1979; LANGONI et al.,1994, VARGAS et al.,1994; GOULART,1995; BANKOVA et al. 1996, PARK et al.,1998; PARK et al. 2000, PINTO, 2000).

    Abaixo segue objetivos e "metodologias parciais" dos dois experimentos realizados. A parcela da metodologia relatada abaixo traz a preocupação de destacar as manipulações realizadas com a própolis, entendendo-se ser o objetivo principal desse artigo apresentar resultados. Maiores detalhes da metodologia, solicitar aos autores via endereço destacado no cabeçalho desse artigo.

Metodologia
Local

    O experimento foi realizado no setor de bovinos do Departamento de Zootecnia (DZO) e as análises laboratoriais foram realizadas no Laboratório de Nutrição Animal (DZO) e no laboratório de microbiologia de anaeróbios do Departamento de Microbiologia da Universidade Federal de Viçosa (UFV), em Viçosa, MG.

Obtenção do extrato de própolis

    Na obtenção do extrato de própolis, foram utilizadas 30 g de própolis bruta triturada para cada 100 mL de solução alcoólica hidratada (70,0%), por um período de 10 dias. Em seguida, foi feita a filtragem em papel de filtro, obtendo-se a solução estoque. Foi feita a diluição da solução estoque utilizando-se 0,0, 16,7, 33,3 e 66,7, da mesma.

Experimento 1

    Objetivo : Determinar in vitro a produção de gases pelos microrganismos ruminais na ausência ou presença de própolis.

    Incubação: Incubou-se 100 mg de feno de brachiária triturado com líquido ruminal coletado segundo normas técnicas. Adicionou-se 0,2 mL de soluçãoalcoólica 70% ou de solução estoque de própolis ( 3 g de própolis para cada 10 mL de solução alcoólica 70%), sendo esta última diluída para 50% da mesma.

    Leituras da pressão e volume dos gases: foram realizadas segundo metodologia proposta por MALAIFAIA et al. (1998), nos seguintes tempos : 0,5, 1 ,2 , 3 ,4 ,5 ,6 ,9 , 12, I 8 ,24 ,30 , 36 ,48 .60 e72 horas após o início da incubação.

    Análises Estatísticas: Para a realização dos ajustes, foi utilizado o processo iterativo de algoritmo de Marquadt, implantado no software Sistema de Análises Estatísticas e Genéticas – SAEG (EUCLYDES, 1993)
 

Experimento 2

    Objetivo: Avaliar a produção de gases in vitro em função de diferentes níveis de própolis e de concentrado (ou volumoso) na dieta

    Incubação: Os seguintes alimentos foram incubados, procurando-se perfazer um total de 50% de NDT² na dieta: 100 mg de gramínea fresca picada (Dieta 1); 50 mg gramínea fresca picada + 31,5 mg de amido do milho (Dieta 2) e 63 mg de amido do milho (Dieta 3).

    Incubou-se, junto ao líquido de rúmen e alimentos, 0,2 mL de solução alcoólica 70% ou de solução estoque de própolis, sendo esta última diluída em 3 níveis (16,7, 33,3 e 66,7%). A monensina, ionóforo bastante utilizado e eficiente na inibição da produção de gases, foi adicionada para servir de parâmetro quanto à eficiência dos extratos de própolis.

    Leituras da pressão e volume dos gases: ídem experimento 1

    Análises Estatísticas: ídem experimento 1
 
 

Resultados

Experimento 1

    Tabela 1 - Produção de gases (volume final total-vf e volume final para carboidratos fibrosos-vfcf) e taxa de digestão específica de carboidratos fibrosos-Kcf e não fibrosos-Kcnf

* Extrato de própolis = Solução estoque (30 g de própolis bruta em 100 ml de solução alcoólica à 70% em água) diluída pela metade com a mesma solução.a > b comparação entre tratamentos (P< 0,05).
Médias na mesma coluna, seguidas por letras distintas, diferem pelo teste F (P<0,05)

    Pode-se evidenciar, através da Tabela 1, a potencialidade da própolis em inibir a produção de gases (menores valores nas colunas 1 e 2) quando comparada ao tratamento controle (obs.: procurou-se utilizar como tratamento controle a solução alcoólica 70% para retirar-se o efeito do álcool do extrato de própolis).

    As colunas 3 e 4 referem-se à taxa de digestão dos substratos fibrosos e não fibrosos da dieta. O que podemos verificar através desses resultados é que o extrato de própolis possibilitou uma maior taxa de digestão dos carboidratos incubados (Kdcf e Kdcnf). O que isso significa?

    Entendendo-se ser essa taxa de digestão correlacionada de forma direta e positiva com a taxa de crescimento microbiano no rúmen, constata-se que, contrariamente à própolis ter tido ação bactericida ou antibacteriana suficiente para reduzir a população microbiana ruminal total (prejudicial para o desempenho animal) e, consequentemente a produção final total de gases, o que teria acontecido é que a própolis teria agido de forma seletiva sobre as bactérias gram-posiivas fermentadoras de metano. No processo simbiótico ruminal, o espaço deixado por essas bactérias passa, geralmente, a ser ocupado por bactérias gram-negativas que se encarregam de aproveitar melhor a energia dos alimentos (lembrar que a molécula de metano é composta de carbono, hidrogênio e oxigênio-CH4 – e que esse carbono e hidrogênio passam a compor a molécula de propionato, ácido graxo fonte de energia para os ruminantes). Daí a não diminuição da taxa de digestão provocada pela própolis.

Experimento 2

    Uma vez constatada a eficiência da própolis em inibir a produção total de gases (experimento 1), a importância recai sobre o estudo de diferentes dosagens de própolis, em níveis econômicos, que resultariam na maior inibição desses gases, ainda, em analogia a um outro ionóforo dado como suficientemente eficiente nessa propriedade (monensina). Ademais, procurou-se testar diferentes relações de alimento volumoso (capim fresco picado) com alimento concentrado (amido de milho).

    Constata-se, através das tabelas 2 e 3, que a própolis em solução estoque diluída para 66,7% da mesma foi eficiente em inibir a produção de gases em todas as dietas, inclusive suplantando a monensina quando incubou-se somente volumoso e mediu-se a produção total de gases advindos de carboidratos fibrosos (Tabela 2).
 

 Tabela 2 - Produção de gases (volume final para carboidratos fibrosos) de três relações volumoso / concentrado tratados com monensina e diferentes níveis de extratos de própolis.

Tratamentos

Controle = solução alcoólica à 70%, Pr (16,7%, 3,3%, 66,7%) = Níveis de solução estoque de própolis (30 g de própolis bruta em 100 mL de olução alcoólica à 70% em água) adicionada da solução alcoólica para perfazer 100%.
Médias contendo letras desiguais, minúsculas nas linhas e maiúsculas nas colunas, diferem pelo teste SNK (P<0,05).

Tabela 3 - Produção de gases (volume final para carboidratos não fibrosos) de três relações volumoso / concentrado tratados com monensina e diferentes níveis de extrato de própolis.

Tratamentos

         Controle = solução alcoólica à 70%, Pr (16,7%, 3,3%, 66,7%) = Níveis de solução estoque de própolis (30 g de própolis bruta em 100 mL de olução alcoólica à 70% em água) adicionada da solução alcoólica para perfazer 100%.
Médias contendo letras desiguais, minúsculas nas linhas e maiúsculas nas colunas, diferem pelo teste SNK (P<0,05).

  Na Tabela 4 pode-se retificar os resultados já apresentados nas Tabelas anteriores. No compito geral, a solução de própolis 66,7% obteve uma média superior à monensina para inibição da produção final de gases. A solução de própolis 33,7% mostrou-se superior ao controle, porém inferior à monensina. Torna-se interessante que uma diluição intermediária (estoque diluída para 50% da mesma) entre essas duas seja testada em analogia à monensina.
 

Tabela 4 – Efeito da própolis e monensina sobre a produção total de gases após 72 horas de incubação de 100 mg de volumoso e concentrado em diferentes proporções.

 Médias seguidas por letras distintas, diferem pelo teste SNK (p<0,05).
 

Conclusões

    Os resultados desse artigo, somados aos do artigo de setembro de 2001, deixam a certeza de que novos experimentos com ruminantes devam ser realizados, tanto in vitro quanto in vivo para testar a própolis como agente ionóforo.

    Cresce, dessa forma, a expectativa de que esse resíduo da atividade apícola, em breve venha a ser requisitado por produtores de ruminantes para melhoria no desempenho dos animais. Por tratar-se de produto natural e relativamente atóxico, existe ainda a possibilidade de seu uso com ruminantes ser também requisitado por grupos de ecologistas, num empenho para a melhoria das condições de vida no planeta. Justifica-se o fato da emissão de metano na atmosfera por esses animais ser uma das poucas fontes de emissão de metano possível de ser manipulada.
 

Referências Bibliográficas

ANUALPEC 2001. Anuário da Pecuária Brasileira. Ed. Argos Comunicação.359p.

BANKOVA, V., MARCUCCI, M.C., SIMOVA, S., NIKOLOVA, N., KUJUMGIEV, A., POPOV, S. Antibacterial diterpenic acids from brazilian propolis. Zeitschrift fur Naturforschung, v.51, n.5-6, p.277-280, 1996.

CRUTZEN, P.J.; ASELMANN, I; SEILER, W. Methane production by domestics animals, wild ruminants, other herbivorous fauna and humans. Tellus 38B: 271-284. 1986.

EUCLYDES, R.F. 1993. Sistema de Análises Estatísticas e Genéticas – SAEG x Guia do usuário. Central de Processamento de Dados, Viçosa, MG.

GHISALBERTI. E.L. 1979. Propolis; a review. Bee World, 60:59-84.

GOULART, C.S. Estudos preliminares sobre atividade "in vitro" do extrato etanólico de própolis (EEP) no combate a bactérias isoladas de processos infecciosos de animais. Salvador, BA: UFBA, 1995. 18p. Monografia - Escola de Medicina Veterinária - Universidade Federal da Bahia, 1995.

LANA, R.P., RUSSELL, J.B., VAN AMBURGH, M.E. The role of pH in regulating ruminal methane and ammonia production. J. Anim. Sci.,.v.76, p.2190-2196, 1998.

LANGONI, H., DOMINGUES, P.F., FUNARI, S.R.C., CHANDE, C.G., NEVES, I.R., LISTONI, F.J.P. Efeito antimicrobiano in vitro da propolis. In:CONGRESO IBEROLATINOAMERICANO DE APICULTURA, 4, 1994, Rio Cuarto, Argentina, Anais... Rio Cuarto, Argentina: Editora, 1994. p. 189-192.

MADIGAN, M.T., MARTINKO, J.M., PARKER, J. Brock biology of microorganisms. Prentice Hall, 8th Ed., p.566, 1997.

MALAFAIA P.A . M., VALADARES FILHO, S.C., VIEIRA, R.A. M. et.al. 1998^ª Cinética ruminal de alguns alimentos investigada por técnicas gravimétricas e metabólicas. R. Bras. Zoot., 27(2):370-80.

MIRZOEVA, O.K., GRISHANIN, R.N., CALDER, P.C. Antimicrobial action of propolis and some of its components: the effects on growth, membrane potencial and motility of bacteria. Microbiology Research, v.152, n.3, p.239-246, 1997.

PARK, Y.K., KOO, H, IKEGAKI, M. et al. 1998. Effect of propolis on Streptococcus mutans, Actinomyces naeslundii and Staphylococcus aureus. Rev. Microbiol., 29:143-148.

PARK, Y.K., IKEGAKI, M., ALENCAR, S.M. 2000. Classificação das própolis brasileira a partir de suas características físico-químicas e propriedades biológicas. Mensagem Doce, 58(9): 3-7

PINTO, M.S. Efeito antimicrobiano de própolis verde do Estado de Minas Gerais sobre bactérias isoladas do leite de vacas com mastite. Viçosa, MG: UFV, 2000. 92p. Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária) - Universidade Federal de Viçosa, 2000

RUSSEL, J.B. & STROBEL, H.J. Minireview: Effect of ionophores on ruminal fermentation. Appl. Environ. Microbiol. 55: 1-6. 1989.

VARGAS, A.C., POCAI, E.A., FONTANA, F.Z., BORSA, A., STULP, S.L. Dados parciais do teste "in vitro" da atividade antibacteriana da própolis. In: Congresso de Medicina Veterinária do Cone Sul, I & Congresso Estadual de Medicina Veterinária, XII. Anais.... Porto Alegre: SOVERGS. 160p.1994.