CINÉTICA DA DIÁSTASE EM MÉIS DE DIFERENTES ORIGENS FLORAIS
UM NOVO PROTOCOLO EXPERIMENTAL
Santos, K.S.1, Malaspina, O.2, Palma, M.S.2
Trabalho baseado no Projeto de Iniciação Científica de Keity Souza Santos sob
orientação do Prof. Dr. Osmar Malaspina e Prof. Dr. Mário Sérgio Palma – Universidade
Estadual Paulista – UNESP – Rio Claro.
1- Graduanda em Ciências Biológicas – UNESP – Rio Claro - Bolsista Iniciação
Científica CNPq.
2- Departamento de Biologia e Centro de Estudos de Insetos Sociais – UNESP –
Rio Claro.
RESUMO
A determinação da atividade diastásica é um dentre os diferentes parâmetros
utilizados na avaliação do mel para determinação de sua qualidade. Entretanto,
os resultados experimentais obtidos em amostras de méis de diferentes origens
florais apresentam amplos desvios-padrão, de maneira geral não confiáveis analiticamente.
As metodologias de ensaio da atividade diastásica atualmente aceitas pela “Codex
Alimentarius Comission” consistem em procedimentos trabalhosos e resultados
pouco confiáveis, pois se baseiam em métodos de difícil reprodutibilidade em
que os ensaios são realizados sob condições em que a resposta cinética da diastase
não é linear, conforme esperado para este tipo de enzima. O presente trabalho
foi desenvolvido com o objetivo de desenvolver um protocolo experimental mais
simples, rápido e analiticamente confiável. Além disso, buscou estabelecer diferentes
limites da atividade desta enzima para os méis tropicais de diferentes origens
florais. Como resultado o protocolo desenvolvido apresentou todos os méis com
resposta cinética do tipo Michaeliana e foram determinados os valores de Km
e Vmax. para os diferentes tipos de méis ensaiados
INTRODUÇÃO
Padrões internacionais são utilizados para comparação e classificação do mel,
onde diferentes variáveis experimentais são consideradas, dentre elas a atividade
diastásica. Entretanto, os resultados experimentais apresentam amplos desvios-padrão,
de maneira geral não confiáveis analiticamente. As metodologias de ensaio da
atividade diastásica atualmente aceitas pela “Codex Alimentarius Comission”
consistem em procedimentos trabalhosos e resultados pouco confiáveis. A maioria
dos métodos utiliza-se de muitas diluições sucessivas, manipula grandes volumes
de solução, exigindo longos períodos de ensaios e muitas vezes sob temperaturas
muito acima daquela em que a diastase se encontra em sua conformação nativa.
Como resultado nenhum dos métodos atualmente em uso é analiticamente confiável,
utilizando-se de condições experimentais em que a resposta cinética da diastase
não é do tipo Michaeliana (gráfico duplo-recíprocos com uma única seção linear),
comportamento típico esperado para este tipo de enzima.
Acredita-se que a diastase seja proveniente do papo da abelha (Ammon, 1949; Rinaudo, 1973), e adicionada ao mel durante sua manipulação, quando a abelha concentra o néctar coletado, convertendo-o em mel. De acordo com White (1994) alguns méis necessitam de um tempo maior de manipulação, tendo, por isso, quantidades variáveis da enzima nos diferentes tipos de mel, de acordo com o grau de hidratação do néctar.
A ocorrência de grandes diferenças quantitativas dessa enzima
em méis de diferentes origens florais sugere possíveis efeitos qualitativos
do mel na atividade desta enzima, ou a presença de substâncias naturais no mel,
que causam interferência na metodologia atualmente em uso.
Diante da pressão econômica cada vez maior os grupos técnicos dos blocos econômicos
regionais, como o Mercosul, têm adotado um rigoroso padrão de controle de qualidade
de produtos naturais como o mel. Estes padrões, em geral, são baseados em méis
monoflorais produzidos e colhidos em regiões de clima frio, como Europa e EUA.
Nestas condições, o Brasil, que possui uma enorme biodiversidade de plantas
que produz diferentes tipos de méis com características tropicais, pode ter
seus produtos considerados “fora do padrão físico-químico”.
Frente a estes fatos, este trabalho teve por objetivo melhorar o protocolo experimental
para determinação da atividade da diastase em méis neotropicais de diferentes
origens florais, além de estabelecer limites naturais para a atividade da diastase
nos tipos de mel mais comuns no Brasil.
MATERIAIS E MÉTODOS
A metodologia foi desenvolvida a partir da introdução de modificações na metodologia
original proposta pela Codex Alimentarius Comission (1998), buscando reduzir
as etapas de diluição e o tempo de ensaio.
Foram analisadas .... amostras de méis provenientes do laboratório de análises
do CEIS (Centro de Estudos de Insetos Sociais), na UNESP – Rio Claro.
O método de ensaio desenvolvido neste trabalho foi executado como se segue:
Para preparação da solução estoque foram adicionados 5g de mel em um béquer
de 50 mL, diluídos em cerca de 20 mL de água destilada e homogeneizado com bastão
de vidro. Adicionou-se volume suficiente de NaOH 0,1N para que a solução atingisse
pH=5,3. A solução obtida foi transferida para um balão volumétrica de 50 mL
e o volume completado com água destilada até a marca de aferição, reservando-se
esta solução.
A seguir, acondicionou-se um tubo de ensaio com tampa (13,0 x 1,5cm) em uma
grade suporte em banho-maria a uma temperatura constante de 40ºC. Foram adicionados
5mL da solução estoque de mel, 500 mL de tampão acetato 0,1 M pH=5,3, 500 mL
de uma solução de cloreto de sódio 0,1N, 50 mL de iodo 0,002N e 250 mL de
solução de amido 1% (m/v), seguindo-se esta ordem.
O volume final da solução era de 16mL, completando-se o volume com água destilada,
que foi adicionada antes da solução de amido. A solução foi homogeneizada em
agitador de tubos do tipo Vortex. Imediatamente acionou-se o cronômetro, realizando-se
uma leitura de absorbância inicial em espectrofotômetro, no comprimento de onda
de 660 nm. Em intervalos de tempo de aproximadamente 5 minutos, devem ser feitas
leituras no espectrofotômetro até que a leitura da absorbância atinja um valor
entre 0,240 e 0,200. Após cada leitura, as amostras foram recolocadas no tubo
de ensaio e retornadas ao banho-maria à temperatura de 40ºC.
O cálculo da atividade diastásica (A.D) se dá através da utilização da fórmula:
Variando-se a concentração de amido foi possível o estabelecimento
da cinética da diastase para verificação do comportamento do tipo Michaeliano.
Através de gráficos duplo-recíprocos foi possível estabelecer os valores das
constantes de Michaelis (Km) e os limites de velocidade (Vmax.) para cada tipo
de mel ensaiado.
RESULTADOS
Como resultado os valores da atividade diastásica (escala Gothe) obtidos em
amostras de mel de diferentes tipos e origens encontraram-se distribuídas entre
12 e 33 para méis de laranjeira, que apresentaram as atividades mais baixas;
40 e 81 para méis de eucalipto, que apresentaram as atividades mais elevadas;
e entre 11 e 35 para os méis silvestres.
Os gráficos dos duplo-recíprocos demonstraram o comportamento típico da atividade
enzimática Michaeliana (uma única seção linear) para os três tipos de méis ensaiados,
apresentando correlações lineares de 0.99, 0.97 e 0.99 para os méis silvestre,
eucalipto e laranjeira, respectivamente (Fig. 1 a 3).
 Fig. 1 – Gráfico duplo-recíprocos mel silvestre |
 Fig. 2 – Gráfico duplo-recíprocos mel eucalipto |
 Fig. 3 – Gráfico duplo-recíprocos mel laranjeira |
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Os valores das constantes de Michaelis (Km) foram de 19.8, 9.5, 10.6 (mg%)-1, para os méis silvestre, laranjeira e eucalipto, respectivamente, demonstrando que não houve uma variação muito grande, se considerado que os méis provém de diferentes origens florais. Este resultado era esperado já que a enzima é adicionada ao mel pela própria abelha (Rinaudo, 1973). Deve-se salientar que os valores de Km entre méis monoflorais, laranja e eucalipto, foram muito próximos entre si. Já as velocidades máximas (Vmáx) foram 309.57, 112.89 e 309.07 U.mL-1.h-1, para os méis silvestre, laranjeira e eucalipto, respectivamente. Estes valores confirmam porque os méis de laranjeira apresentam as menores atividades diastásicas, já que seu valor de Vmax é aproximadamente 63% menor que dos outros dois tipos de mel ensaiados. Esse resultado sugere ser possível a presença de um inibidor do tipo não competitivo, que não interfere no valor de Km, mas diminui significativamente sua velocidade de processamento.
CONCLUSÃO
A metodologia desenvolvida permitiu o estabelecimento de limites aproximados
da atividade diastásica para os diferentes tipos de mel ensaiados. O método
considera todas as variáveis experimentais de maneira contínua. Não há necessidade
de sucessivas diluições; os reagentes utilizados não são desperdiçados, pois
é possível a manipulação de diferentes amostras simultaneamente e, além disso,
o ensaio é rápido, levando menos de uma hora para obtenção da leitura final.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AMMON, R. Der Ursprung der Diastase des Bienenhonigs. Biochemistry Z. n. 319,
p. 295-299, 1949.
CODEX ALIMENTARIUS COMISSION – Food and Agriculture Organization of the United
States – World Health Organization, 1998
RINAUDO, M.T.; PONZETTO, C.; VIDANO, C.; MARLETTO, F. The origin of honey amylase.
Comp. Biochem. Physiol, v.46, n. 2B, p. 253-256, 1973.
WHITE, J.W. The role of HMF and diastase assays in honey quality evaluation.
Bee World. v.75, n.3, p.104-117, 1994.
